Clomeleon Biosensor-Mauslinien zur optophysiologischen Bestimmung der intrazellulären Chloridkonzentration in Nervenzellen - Schleich, Wolfram Bernhard (2006)
Chlorid hat eine weitreichende Bedeutung für die neuronale Signalverarbeitung. Seine intrazelluläre Konzentration entscheidet, ob GABA oder Glyzin eine erregende oder hemmende Wirkung auf Nervenzellen haben. Entgegen seiner physiologischen Bedeutung stehen nur wenige, mit Problemen in der Anwendung behaftete Techniken zur Verfügung, um intrazelluläre Chloridkonzentrationen messen zu können. Clomeleon ist ein ratiometrischer, genetisch kodierter Chloridindikator bestehend aus einer Fusion von cyan- und gelb-fluoreszierendem Protein, der nichtinvasive Chloridmessungen an lebendem Gewebe erlaubt. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit Strategien diesen Indikator in Biosensor-Mauslinien nutzbar zu machen und deren Anwendbarkeit anhand der Frage nach der Entwicklungsabhängigkeit der Chloridkonzentration von Neuronen zu testen. Es wurden sieben Linien transgener Mäuse generiert, die den Indikator unter Kontrolle des Thy1-Promotors exprimieren. Die Linien unterschieden sich in dem Expressionsmuster von Clomeleon. Generell wurde in diesen Linien eine weitverbreitete und hohe Expression des Indikators gefunden. Diese Mauslinien sind für Populations-Imaging gut geeignet. Einzelzell-Imaging ist durch die dichte Expression anspruchsvoll und verlangt nach einem quantitativen Ansatz, der unter definierten Messbedingungen die Ermittlung eines Hintergrundes erlaubt. Unter Beachtung dieser Einschränkung konnte an akuten Hirnschnitten dieser Linie der postulierte Abfall intrazellulärer Chloridkonzentrationen in Nervenzellen nach der Geburt gezeigt werden. Ausgehend von einer Konzentration von 21 mM bei P5 fällt die Chloridkonzentration bis auf 6 mM bei P20. Daraus folgt eine Umpolung der GABAergen Antwort bei P14. Darüberhinaus wurde eine universelle Clomeleon-Indikatormauslinie auf Basis des ubiquitär aktiven ROSA26-Promotors und einer loxP-flankierten Stopp-Kassette erzeugt. Durch Verpaarung mit einer Cre-Aktivatormauslinie erlaubt diese Linie die Expression des Indikators in genetisch definierten Zellpopulationen. Dieses Konzept birgt enorme Möglichkeiten zur Verbesserung der Imagingbedingungen. Einerseits stammt alles gesammelte Licht aus derselben genetisch identifizierten Zellpopulation, was die Aussagekraft von Populationssignalen erhöht. Andererseits besteht für das Einzelzell-Imaging die Chance vereinzelt stehende markierte Zellen zu erhalten, was die für quantitatives Imaging notwendige Hintergrundsbestimmung vereinfacht. Durch die niedrige Expression von Clomeleon in Nervengewebe sind intensitätsbasierte Imagingmethoden nur sehr eingeschränkt möglich, die Verwendung von 2P FLIM bietet jedoch eine sehr erfolgversprechende Möglichkeit, quantitative Messungen trotz der niederen Fluoreszenz durchführen zu können. Ein vergleichbares Konzept verfolgten wir durch Kombination von viralen Gentransfer und Techniken konditionaler Genaktivierung. Hier gelang es durch Infektion mit dem für Zellen völlig untoxischen rekombinanten AAV1/2-Virus in transgenen Aktivator-Mauslinien eine ausserordentlich hohe Expression von Clomeleon in genetisch definierten Nervenzellen zu erhalten. Diese Situation schafft ideale Voraussetzungen für das Imaging einzelner Zellen. Es konnte gezeigt werden, dass die chronische Expression von Clomelon in Biosensor-Mauslinien erfolgreich zur nichtinvasiven, optophysiologischen Darstellung der intrazellulären Chloridkonzentration eingesetzt werden können. Damit steht ein neues Werkzeug zur Verfügung, mit welchem viele, bisher experimentell nicht zugängliche biologische Fragestellungen nunmehr untersucht werden können.