Charakterisierung des molekularen Mechanismus der Stabilisierung des Peptidtransporters TAP durch das ER-Glykoprotein Tapasin - Papadopoulos, Martina (2006)
Haupthistokompatibilitäts-(MHC)Klasse-I-Moleküle präsentieren den CD8+-T-Lymphozyten intrazellulär prozessierte Antigene. Die Präsentation ist durch eine Vielzahl an Hilfsproteinen einschließlich Tapasin (Tpn) und dem Transporter associated with Antigen Processing (TAP), der aus den nicht kovalent verknüpften TAP1- und TAP2-Untereinheiten besteht, reguliert. Das ER-residente Glykoprotein Tpn hat eine duale Chaperonfunktion, indem es die Peptidfracht der MHC-Klasse-I-Moleküle innerhalb des TAP-assoziierten Peptidbeladungskomplex optimiert und unabhängig davon das Expressionsniveau von TAP reguliert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Stabilität der TAP-Untereinheiten in Anwesenheit und Abwesenheit von Tpn untersucht. Dazu wurden TAP1- und TAP2-Untereinheiten voller Länge und N-terminal verkürzte TAP1- und TAP2-Untereinheiten, die jeweils C-terminal mit EGFP markiert waren, entweder in TAP1/2-defizienten und Tpn-/--MC4-Zellen oder in Tpn-kompetenten MCB6TAP1-/--Zellen exprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass die N-Domäne von TAP2 für die Tpn-vermittelte Stabilisierung des TAP1/TAP2-Heterodimers wichtig ist. TAP1 war in Abwesenheit von Tpn dagegen stabil. Die TAP2-Untereinheit war daher das geeignete Indikatormolekül, um den kaum verstandenen molekularen Mechanismus der Tpn-vermittelte TAP-Stabilisierung in Tpn-transfizierten MC4-Zellen detailliert zu untersuchen. Hierfür wurden einerseits in der Transmembrandomäne (TMD) und/oder im N-terminal angrenzenden Verbindungspeptid (CP) von Maus(m)-Tpn einzelne oder multiple konservierte Aminosäuren ausgetauscht und andererseits mTpn-TMD-Chimären hergestellt in denen die TMD von mTpn durch heterologe TMD ausgetauscht wurden. Zunächst stellte sich heraus, dass ausgewählte einzelne konservierte Aminosäuren in der TMD von mTpn keine signifikante Rolle bei der TAP-Stabilisierung spielen. Nur die Substitution eines hochkonservierten sauren Motivs (E414/D415) im CP reduzierte die TAP2-Stabilisierung drastisch. Allerdings funktionierte das saure Motiv nicht unabhängig von der Tpn-TMD. Durch weitere Mutationsanalysen konnte zum ersten Mal eine einzelne Aminosäure im CP identifiziert werden, die an der TAP-Stabilisierung beteiligt ist und zwar Glu in der Position 414. Die Ergebnisse des Austausches multipler Aminosäuren innerhalb der TMD zeigte, dass die TAP-Stabilisierungsfunktion von Tpn nicht durch einzelne, sondern durch ein räumliches Motiv an einer Flanke der membranquerenden Helix von Tpn bestehend aus den konservierten Aminosäuren F420, F424, G428, K431 und W435 ausgeübt wird. Der kombinierte Austausch von E414 im CP und des räumlichen Motivs erbrachte einen kompleten Verlust der Tpn-vermittelten TAP2-Stabilisierung und zeigte damit eine kooperative Wirkung dieser funktionsbestimmenden Aminosäuren auf. Die konservierten Aminosäuren des räumlichen Motivs befinden sich hauptsächlich im N-terminalen Teil der TMD von Tpn und interagieren vermutlich mit einer oder mehreren Transmembranhelices innerhalb der N-Domänen von TAP. Dagegen interagiert die ER-luminal exponierte Aminosäure E414 möglicherweise mit einer basischen Aminosäure in einer ER-exponierten Schleife innerhalb der N-Domänen von TAP. Die beschriebenen konservierten Aminosäuren scheinen zwar notwendig, aber nicht ausreichend für die Tpn-Funktion zu sein, da sie sich nicht in die TMD von Calnexin transplantieren ließen. Der Sequenzkontext innerhalb der TMD von Tpn liefert vermutlich zusätzliche essentielle Informationen. In Anwesenheit von verschiedenen Tpn-Mutanten konnte gezeigt werden, dass bereits deutlich reduzierte TAP2-Mengen ausreichen, um die peptidtransportabhängige MHC-Klasse-I-Expression zu induzieren. Die MHC-Klasse-I-Induktion war in guter Korrelation mit der TAP2-Stabilisierung. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die konservierten Aminosäuren F420, F424, G428, K431 und W435, die ein räumliches Motiv innerhalb der TMD bilden, und die saure Aminosäure E414 im CP für die Tpn-vermittelte Stabilisierung von TAP2 notwendig sind. Für die TAP1-Stabilisierung scheint Tpn keine entscheidende Rolle zu spielen.
Keywords: Hochschulschrift