In vitro Selektion von Ribozymen für eine Aldolreaktion: Isolierung und Charakterisierung von Nukleinsäuren mit katalytischen Eigenschaften - Weigand, Barbara-Sylvia (2006)
Durch die in vitro Selektion konnte im Laufe der letzten 20 Jahre eine Reihe an künstlichen RNA-Enzymen (Ribozyme) entwickelt werden. Die Fähigkeit der Ribozyme, eine große Bandbreite an organischen Reaktionen zu katalysieren, unterstützt die Hypothese der RNA-Welt, der zufolge in einer früheren Welt metabolische Umwandlungen durch RNA-Moleküle bewerkstelligt wurden. Die Bindungsausbildung zwischen zwei Kohlenstoffatomen dürfte in solch einer Welt auch bereits eine erhebliche Rolle gespielt haben. In der Natur werden Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen überwiegend durch Aldolreaktionen gebildet, wobei Aldolasen die Reaktion in einem Enaminmechanismus (Klasse I) oder mit Hilfe von Zinkionen (Klasse II) katalysieren. Diese Arbeit beschreibt die Etablierung einer Selektionsstrategie zur Generierung von Ribozymen, die eine Aldolreaktion ähnlich den Aldolasen katalysieren sollen. Für die direkte in vitro Selektion mit photospaltbaren linkerkoppelten Reaktanden wurden zwei verschieden lange RNA-Bibliotheken verwendet. Die Einführung des Aldoldonors an den 3-Terminus der kombinatorischen Bibliotheken erfolgte über einen flexiblen Dinukleotidlinker durch enzymatische Ligation. Nach stattgefundener Reaktion mit dem biotinylierten Aldolakzeptor konnten aktive RNA-Moleküle durch Affinitätschromatographie von nicht-umgesetzten Sequenzen abgetrennt und durch die im Linker enthaltene photospaltbare o-Nitrophenyleinheit selektiv freigesetzt werden. Die Photospaltstelle im Linker sollte hierbei die Regioselektivität der Aldolreaktion und eine ungewollte Anreicherung an Spezies, die Nebenreaktionen bevorzugen, gewährleisten. In dem kürzeren Pool, der einen randomisierten Bereich von 70 Nukleotiden aufwies, wurde eine Anreicherung an Spezies beobachtet und nach 13 bzw. 14 Runden kloniert und sequenziert. Es wurden insgesamt 85 Sequenzen isoliert, die in 12 Familien mit insgesamt 34 Mitgliedern eingeteilt werden konnten. Sekundärstrukturanalyse und -vergleiche wurden durchgeführt. Zur kinetischen Charakterisierung der isolierten Sequenzen wurden verschiedene Ansätze ausgetestet. Die genauer charakterisierten Spezies beschleunigen die Reaktion zwischen dem 230- und 500-fachen und weisen eine scheinbare Geschwindigkeitskonstante zwischen 2.4 ∙ 10-5 und 5.3 ∙ 10-5 M-1s-1auf. Durch die erfolgreiche Selektion von Sequenzen, die eine Aldolreaktion beschleunigen, konnte das Reaktionsspektrum, das durch RNA katalysiert wird, ausgebaut und die Hypothese der präbiotischen RNA-Welt weiter untermauert werden.