Analyse von DNA- und RNA-Modifikationen durch Fluoreszenz-Postlabeling mit BODIPY und Kapillarelektrophorese mit Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion - Cornelius, Michael Günter (2006)
90% aller Substanzen, die beim Menschen Krebs auslösen, verursachen strukturelle Veränderungen an der DNA, sie wirken genotoxisch durch Bildung von Addukten bzw. Modifikationen. Diese DNA-Modifikationen können endogenen oder exogenen Ursprungs sein. Die Detektion und Analyse von DNA-Modifikationen ist daher von großer Bedeutung, nicht nur für die Bestimmung der biologisch effektiven Dosis der genotoxischen Substanz, sondern auch für die Aufklärung des Zusammenhangs zwischen Exposition und Krebsrisiko. Da DNA-Addukte in vivo nur in geringen Konzentrationen auftreten, ergeben sich höchste Anforderungen an eine Analysen-Methode zu ihrem Nachweis. In dieser Arbeit wurde eine neue Methode zum Nachweis von DNA- und RNA-Modifikationen entwickelt und validiert. Sie beruht auf der enzymatischen Hydrolyse von DNA bzw. RNA zu Nukleosid-5-Monophosphaten, deren chemischer Markierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff (BODIPY-FL-EDA), sich anschließender Trennung mit mizellarer elektrokinetischer Chromatographie und Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion (CE-LIF). Zur Methodenentwicklung wurden sowohl synthetische Standardverbindungen der Modifikationen, modifizierte 2-Desoxy- und Ribo-Oligonukleotide, als auch definiert modifizierte Lambda-DNA eingesetzt. Die neue Methode ist in der Lage verschiedene, durch oxidativen Stress und Deaminierungen verursachte DNA-Modifikationen (8-Oxo-Guanin, 8-Oxo-Adenin, Uracil, Inosin), sowie die epigenetisch interessanten Methyl-Modifikationen von Cytosin und Adenin (5-Methylcytosin, N6-Methyladenin) mit hoher Präzision, Selektivität und Empfindlichkeit nachzuweisen. Die Nachweisgrenze der DNA-Modifikationen lag bei 100pM (50attomol, 3 Addukte je 107 normale Nukleotide) für N6-Methyladenin, 200pM (ca. 100attomol, 6 Addukte je 107 normale Nukleotide) für Uracil und Inosin und 1nM für 8-Oxo-Guanin und 8-Oxo-Adenin (3 Addukte je 106 normale Nukleotide), die der RNA-Modifikationen bei 80pM (40attomol, 2 Addukte je 107 normale Nukleotide) für Pseudouracil und 2-O-Methyladenin. Die schlechtere Detektierbarkeit der Guanin-Modifikationen konnte auf eine basenspezifische Fluoreszenzlöschung des Farbstoffes zurückgeführt werden. Mit der validierten Methode wurden verschiedene Basenmodifikationen in in vitro modifizierter Kalbsthymus-DNA und der Anteil der natürlich vorkommenden, seltenen Base Pseudouracil in RNA verschiedener Organismen bestimmt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Analysenbedingungen der älteren Variante der Methode, die auf dem Verdau von DNA zu 2-Desoxynukleosid-3-Phosphaten mit anschließender Fluoreszenzmarkierung und CE-LIF Analyse beruht, optimiert. Hiermit gelang es verschiedene Deaminierungsprodukte und oxidative Schäden in in vitro behandelter Kalbsthymus-DNA zu bestimmen. In Bezug auf ihre Empfindlichkeit und Genauigkeit erwiesen sich beide Varianten als gleichwertig. Des Weiteren wurde speziell für N6-Methyladenin eine Analysenmethode ausgearbeitet und validiert, und so der Adenin-Methylierungsgrad von Lambda-DNA aus Wildtyp E. coli bestimmt (0.59%).
Keywords: Hochschulschrift